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技术支持

液相色谱法地榆中金丝桃苷的含量的测定
发布时间:2011-05-17   点击次数:1045次

一、实验背景 
1、目的:建立地榆中金丝桃苷的液相色谱含量测定方法。 
2、方法:采用RP-HPLC测定,C18柱,流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54),用三乙胺调pH至3.0,流速1.0ml·min-1,检测波长370nm;供试品溶液的制备采用甲醇超声提取。 
3、结果:测定了不同产地不同批次的地榆药材,金丝桃苷质量分数在0.052%~0.291%。结论该方法灵敏快速,准确可靠,可用于地榆的质量控制。 
4、意义:地榆为蔷薇科植物地榆或长叶地榆的干燥根。其味苦、酸、涩,微寒,具有凉血止血、解毒敛疮之功效。现代药理研究表明其具有显著的镇痛作用,主要有效成分为黄酮类化合物,但药典记载质量标准的定量检测方法仅为紫外-可见分光光度法测定其鞣质含量,该法操作繁琐。金丝桃苷为地榆药材中提取得到的黄酮类化合物。研究表明,地榆中的金丝桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本实验采用RP-HPLC法对不同产地中药材市场商品地榆的金丝桃苷成分进行了定量分析,考察了流通商品地榆的质量状况,为进一步提高地榆药材的质量控制提供了科学依据。 

二、仪器与试药 
1、液相色谱仪,含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、智能柱温箱、紫外可见光检测器(VWD)、化学工作站。超声波清洗器。 
2、地榆的干燥根或饮片。实验中将样品粉碎后过100目筛,置干燥器中备用。 
3、金丝桃苷(111521-200303,国药品生物制品检定所,供含量测定用)。甲醇为色谱纯,实验用水为Milli-Q超纯水。其他试剂均为分析纯。 

三、方法与结果 
1、对照品溶液的制备 
精密称取金丝桃苷13.25mg,置量瓶中,加甲醇定容至25ml,其金丝桃苷含量为0.53mg·ml-1。再精密吸取金丝桃苷对照品溶液2.0ml,加甲醇定容至50ml量瓶中,其金丝桃苷含量为0.0212mg·ml-1。 
2、供试品溶液的制备 
取地榆干燥药材或饮片的粉末(过100目)1g,分别精密称定,至具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100ml,称定重量,超声提取1h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,用续滤液作为供试品溶液。 
3、色谱条件 
HypersilODS2分析柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相甲醇-0.2%磷酸溶液(46:54),用三乙胺调pH至3.0;流速1.0ml·min-1;检测波长370nm;柱温25℃;进样量10μl;在选定的色谱条件下,色谱柱的分离效率(简称柱效)>理论塔板数以金丝桃苷峰计算不低于3000。分离度大于1.5,拖尾因子在0.95~1.05。 
4、检测波长的选择 
取金丝桃苷对照品适量,用甲醇溶解后作紫外全波长扫描,λ286,370nm,因286nm下非黄酮物质也有吸收,为避免干扰,选择检测波长为370nm。 
5、线性关系的考察 
分别精密吸取0.0212mg·ml-1的金丝桃苷对照品溶液2,4,6,8,10,12,16μl注入液相色谱仪,测定基线构成之面积称峰面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h>峰面积,以金丝桃苷含量(X)为横坐标,其峰面积吸收度积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,其回归方程为:Y=2263.9X+2.9635,r=0.9998(n=7),表明金丝桃苷在0.04~0.34μg线性关系良好。 
6、精密度实验 
精密吸取0.0212mg·ml-1金丝桃苷对照品溶液10μl,连续进样5次,测得峰面积积分值RSD为0.86%,表明精密度良好。 
7、重复性实验 
精密称取同一样品粉末1g(5份),按供试品溶液的制备方法制备,进样10μl,测得金丝桃苷含量的RSD为0.99%,表明该方法的重复性好。 
8、稳定性实验同一供试品溶液,从制备完毕开始放置,分别于0,2,4,6,8,10h进样检测,其峰面积积分值RSD为1.9%。表明供试品溶液在10h内比较稳定。 
9、加样回收率实验 
取已知含量的药材(6号含量1.60mg·g-1)样品6份,每份0.50g,精密称定,计算样品中金丝桃苷量,分别加入适量的金丝桃苷对照品,按样品制备方法和测试条件进行测定,计算加样回收率。 
10、样品测定 
分别精密吸取各样品10μl进样测定,计算含量。 

四、实验结果讨论 
1、提取条件的选择 
根据金丝桃苷的溶解性能,选择乙醇、甲醇、醋酸乙酯作为提取溶剂,比较了3种提取溶剂提取方法(超声、回流及索氏提取)和不同提取时间(0.5,1.0,1.5h)对提取效果的影响。结果显示采用超声提取方法的提取率zui高,甲醇提取效果,含量结果表明超声提取1.0h可使待测成分提取完全。实验证实,含量并未随着提取时间延长而有所增加,超过1h时含量甚至有下降的趋势。 
2、流动相的选择 
由于金丝桃苷为黄酮类化合物,本实验采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流动相体系,但实验中发现拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。>色谱峰有拖尾现象。经反复实验发现,在1000ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8ml三乙胺时的分离效果*,经多次,多批样品测试,系统具有良好的重复性和稳定性,三乙胺能与ODS柱中键合相的残余硅醇基相互作用,提高分离度,有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液(46∶54)用三乙胺调pH至3.0为优,分离效果较好,保留时间适中,且无干扰[3]。本方法操作简便、快速、重复性好,适用于地榆中金丝桃苷含量的测定。 
3、样品分析 
对不同产地地榆中的金丝桃苷含量进行了测定,结果表明,不同产地金丝桃苷的含量存在着一定的差异,有必要对其进行质量控制。 



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