食品中罗丹明B（玫瑰红）的现场快速检测及实验室检测方法
更新更新时间：2013-04-18
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1．定义
罗丹明B是一种具有鲜桃红色的人工合成的染料，英文名：Rhodamine B；分子式C28H31ClN2O3；分子量479.0175；结构式为：
罗丹明B在溶液中有强烈的荧光, 用作实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃等行业。不容许用作食品染色。
2．检测原理
罗丹明B具有脂溶性，被用作调味品（主要是辣椒粉和辣椒油）染色剂。使用了被污染的调味品制作食品时会造成残留。调味品使用罗丹明B染色时含量较高，甚至直接掺入，可进行现场检测。食品中因其含量较低，需送实验室检测。现场检测中使用非极性有机溶剂（例正己烷、正己烷+丙酮等）将其溶解并提取出，提取液流过中性氧化铝固相萃取小柱吸附罗丹明B，用非极性有机溶剂（例正己烷）淋洗小柱，洗脱样品油脂和食品内源性干扰物，用肉眼可观测到在小柱上出现鲜亮的粉红色条带，判定为可疑样品，该样品需送实验室作进一步确证检验。实验室检测法仍然采用非极性有机溶剂（例正己烷、正己烷+丙酮等）将罗丹明B 从食品中溶解并提取出，提取液流过中性氧化铝固相萃取小柱吸附罗丹明B，用非极性有机溶剂（例正己烷）洗脱样品油脂和食品内源性干扰物，再用极性有机溶剂（例甲醇）将罗丹明B从小柱上洗脱并收集，用反相液相色谱仪-紫外/可见光检测器进行定性定量检测。
3．试剂和材料
3.1 层析用中性氧化铝（100目），用前于105℃烘2小时，取下置干燥器中冷至室温，装入玻璃瓶中密闭放置。
3.2 正己烷（分析纯）；
丙酮（分析纯）；
甲醇（色谱纯）；
3.3 20%丙酮的正己烷液：取100ml丙酮加400ml正己烷混合，作为罗丹明B的提取液和净化液。
3.4 氧化铝固相萃取小柱：取5 ml塑料注射器管，下端口塞入小块脱脂棉，装入处理好的氧化铝约3cm高，放置备用。
3.5 罗丹明B标准溶液：称取罗丹明B （分析纯试剂 沈阳试剂三厂）5.0mg，用20%丙酮的正己烷液（3.3）溶解并定容至50ml，配成含量为100ug/ml的标准储备液。取此液0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0ml，用20%丙酮的正己烷液（3.3）稀释并定容至50ml，配成浓度为 0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ug/ml标准系列溶液。
3.6 玻璃器具
4．现场快速检测方法
4.1 辣椒粉 取辣椒粉一小勺（约5g）放入小烧杯中，加入约40ml含20%丙酮的正己烷（3.3），摇动或搅拌2分钟，静置。取5 ml塑料注射器套管，下端口塞入小块脱脂棉，将事先处理好的氧化铝（3.1项）倒入注射器管中约3cm高，做成氧化铝固相萃取小柱，待样品杯上方澄清后，慢慢倒入小柱中，下端接一废液杯，视颜色深浅倒入2-5ml，注意不要倒入太多，保证小柱的中下部仍为白色， 此时，含罗丹明B的样品在柱上部会出现鲜亮的粉红色的荧光条带，条带边缘清晰，粉红色随含量的增加而加深和加宽，不含罗丹明B的样品提取液不会出现粉红色条带，只会出现黄红色的界面不清晰的宽带，然后用含20%丙酮的正己烷（3.3）20ml慢慢倒入小柱，粉红色的条带不下移，但更清晰，其余的黄红色带下移，可大部分被洗脱出，即可判断为含罗丹明B的可疑样品。
4.2 辣椒油 取辣椒油一小勺（约2g）放入小烧杯中，加入约10ml正己烷（3.2），混匀。按4.1项中“取5 ml塑料注射器套管，……即可判断为含罗丹明B的可疑样品。”操作。
4.3 判定 初步判断为含罗丹明B的可疑样品需送实验室中进行液相色谱确证检验。
5．实验室检测方法
5.1．仪器
液相色谱仪 （双泵、紫外/可见光检测器）
色谱柱 C18 4.6mm X 15cm（5μm）
5.2．提取和纯化
5.2.1 辣椒粉：取辣椒粉1g，加入20ml含20%丙酮的正己烷（3.3），震摇10分钟，静置或过滤使分离出上层清液，残渣加入10ml含20%丙酮的正己烷（3.3）重复提取一次，合并2次提取液，混匀，用滴管将上清液加入氧化铝小柱（3.4）中[小柱预先用5ml提取液（3.3）润湿]，视颜色深浅决定上柱量，保证上完样的小柱中下部仍为白色，含罗丹明B的样品提取液在柱上部会出现鲜亮的粉红色的荧光条带，且粉红条带随含量的增加而加深和加宽，不含罗丹明B的样品提取液不会出现粉红色条带，只会出现黄红色的不清晰的宽带，用含20%丙酮的正己烷（3.3）洗小柱，粉红色的条带不下移，但更清晰，其余的黄红色带下移可大部分被洗脱出，可判断为含罗丹明B的可疑样品，待洗柱的流出液无色时，滴入5-10ml甲醇，将罗丹明B色带洗下并收集，用甲醇定容后，注入液相色谱仪进行确认。
5.2.2．辣椒油：称取辣椒油1g，加入10ml含20%丙酮的正己烷（3.3），混合均匀后滴入氧化铝小柱（3.4）中，按照5.2.1项中“用滴管将上清液加入氧化铝小柱……注入液相色谱仪进行确认”进行操作。
5.2.3.其它食品：对于使用了红辣椒油（粉）调味的食品（如红油豆制品、红油鱼干等）称取10-20g，用20%丙酮的正己烷（3.3）洗下红油（粉），或将样品与洗脱液搅成匀浆将罗丹明B溶解提取出，将样品液静置或离心，分出有机相，根据水分的多少加入适量无水硫酸钠脱水，按照5.2.1项中“用滴管将上清液加入氧化铝小柱……注入液相色谱仪进行确认”进行操作。含量少的样品因粉红色条带太窄和颜色较淡肉眼看不清楚，仍可采用上述办法，进一步用20%丙酮的正己烷（3.3）洗涤小柱至流出液无色时，滴入5-10ml甲醇，将罗丹明B色带洗下并收集，经浓缩后，注入液相色谱仪进行确证检验。
5.3 液相色谱条件
5.3.1 色谱柱：C18 4.6mm X 15cm（5μm） 进样 5ul
5.3.2 流动相：75%甲醇水溶液 1ml/min
5.3.3 检测器: 紫外/可见光（UV/VIS）检测器；波长：550nm
5.3.4 定性定量：罗丹明B标准溶液保留时间定性，外标法定量。
5.4 结果计算
Y = C×V/M
Y——样品中罗丹明B的含量（mg/kg）
C——从标准曲线上查得的罗丹明B的浓度（ug/ml）
V——测试样品总定容体积（ml）
M——样品的称样量（g）
5.5 注意事项：①使用C18柱的性能有差异，流动相浓度应略作调整。②在本法所给分离条件下，样品基质在罗丹明B附近无干扰峰，其他许多红色偶氮染料均可在罗丹明B之后出峰，注意调整这些干扰峰与罗丹明B分离度，干扰的成分为：苏丹橙G、对位红、苏丹红7B、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ。（色谱仪器网）
